Die Nukleinsäuresynthese wird mithilfe der Festphasen-Sialinsäureamid-Triglycerid-Methode durchgeführt, wobei das 3‘-Ende der DNA auf einem Festphasensubstrat immobilisiert wird und Nukleotide in der 3‘- bis 5‘-Richtung hinzugefügt werden, bis das gewünschte DNA-Fragment synthetisiert ist .Dies unterscheidet sich von der DNA-Synthese durch den Einsatz von DNA-Polymerase.
Das 3‘-Ende der ersten Base wird während der Synthese auf CPG immobilisiert, das 5‘-OH der nächsten Base wird mit Di-p-tolyltrityl DMT geschützt, die Aminogruppe an der Base wird mit Benzoesäure geschützt und das 3‘-Ende der nächsten Base wird mit Di-p-tolyltrityl DMT geschützt. -OH wird dann mit einer Aminophosphatverbindung aktiviert.1 Base des 5 5′-OH von 1 Base und 3′-OH der nächsten Base bilden ein Phosphittriglycerid, das dann mit Jod zu einem Phosphattriglycerid oxidiert wird, wobei der Schutzstoff auf der zweiten Base 5′-OH entfernt wird Durch die Zugabe von Dichloressigsäure DM wird die nächste Base hinzugefügt, und nach der Synthese wird das Schutzmittel am 5′-OH mit einer schwachen Säure entfernt. Das Fragment wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid vom festen Harz getrennt, das Schutzmittel wird von der Base entfernt mit konzentriertem Ammoniumhydroxid unter Erhitzen, das Ammoniumhydroxid wird entfernt, das Fragment wird vakuumgetrocknet und die Nukleinsäure wird durch Flüssigkeitschromatographie oder PAGE gereinigt.
Schritte der Oligosynthese
Entsperren
DerDie DMT-Schutzgruppe am Ende 5 wird durch Zugabe einer TCA-Lösung entfernt.
Aktivierung
Mischen des Aktivators mit dem Oligonukleotidmonomer, um das aktive Oligonukleotidmonomer-Zwischenprodukt zu bilden.
Kupplung
Die 5-terminale Hydroxylgruppe reagiert mit dem aktiven Oligonukleotid-Zwischenprodukt in einer antigenerativen Kondensationsreaktion und bildet eine instabile Phosphit-Triglycerid-Bindung.
Verschließen
Die Zugabe eines Verkappungsmittels führt zu einer Acetylierungs-Verkappungsreaktion mit überschüssigen Hydroxylgruppen, die nicht an der Kondensationsreaktion beteiligt sind.
Oxidation
Durch die Zugabe von wasserhaltiger Jodlösung werden instabile Phosphitbindungen durch Oxidation zu stabilen Phosphorsäuretriglyceridbindungen reagiert.
Cyanoethyl-Spaltung
Das Nukleinsäureprodukt nach der Synthese mit der Zugabe einer DEA-Lösung zur Entfernung der Cyanoethylgruppe aus der Phosphattriglyceridbindung.
Gespalten und entschützt
Die Nukleinsäurefragmente werden durch Zugabe einer konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung vom Festphasenträger abgespalten und anschließend erhitzt, um die Schutzgruppen von den Wasserstoffbrückenbindungen der Basen zu entfernen.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 21. November 2022